본 연구의 목적은 간세포 성장인자(HGF)로 조절된 중간엽 줄기세포(HGF-MSCs)의 외소체가 miR-221-5p/NLRP1 매개 자가포식 조절을 유도하여 폐쇄성 세기관지염(BO) 기도 상피세포의 상피-간질 전이(EMT) 및 염증에 미치는 역할과 기전을 탐구하는 것이다. 방법으로 탯줄 MSCs에서 HGF 초과 발현 후 외소체(HGF-MSCs-EXO)를 분리하였다. 전자현미경으로 외소체 형태 관찰, 입자 크기 분석기로 크기 분포 측정, Western blotting으로 마커 단백질 CD63 및 암감수성 유전자 101(TSG101) 발현 확인, qRT-PCR로 HGF mRNA 발현을 검출하여 HGF-MSCs-EXO 구축 여부를 검증하였다. BO 마우스 모델 및 지질다당류(LPS) 유도 TC-1 세포 BO 체외 모델을 구축하고 HGF-MSCs-EXO 처리 후 조직학적 검사를 통해 기도 조직 손상 정도를 평가하였다. Western blotting으로 자가포식 관련 단백질(Beclin1, ATG5, p62) 발현을 측정하고, ELISA로 염증 인자(IL-6, IL-1β, IFN-γ) 농도를 분석했으며, Western blotting으로 EMT 표지 단백질(α-SMA, 비멘틴, E-카드헤린) 발현을 탐색하여 HGF-MSCs-EXO가 BO에 미치는 영향을 연구하였다. 또한 miR-221-5p 억제제 및 활성제 전이를 통해, NLRP1 발현 저하 실험과 이중 루시퍼레이스 리포터 및 CHIP-qPCR 실험을 병행하여 miR-221-5p와 NLRP1의 표적 관계 및 HGF-MSCs-EXO가 BO 조절 과정에서의 역할을 명확히 하였다. 결과적으로, 전자현미경 하에서 컵 모양 또는 낭포 형태를 보였고, 나노입자 추적 분석기(NTA)로 30~150 nm 크기를 나타냈으며, CD63, TSG101 마커 단백질이 발현되고 HGF mRNA가 고발현되어 HGF-MSCs-EXO가 성공적으로 구축되었음을 확인하였다. 체내 실험에서 대조군과 비교할 때 모델군 BO 마우스의 기도 손상은 심각하였고, 자가포식(Beclin1, ATG5 상승, p62 감소), 염증(IL-6, IL-1β, IFN-γ 상승), EMT(E-카드헤린 감소, α-SMA, 비멘틴 상승)의 지표들이 비정상적으로 나타났다(P<0.05). HGF-MSCs-EXO 처리 군에서는 위 지표들과 병리 손상이 유의하게 개선되었다(P<0.05). 체외 실험에서 PKH26 형광을 통해 세포가 HGF-MSCs-EXO를 섭취함을 확인하였으며, 무처리 대조군 대비 LPS 모델군은 자가포식, 염증, EMT 변화가 체내 실험과 일치하였고, miR-221-5p는 감소하고 NLRP1은 상승하였다(P<0.05). HGF-MSCs-EXO는 이러한 변화를 반전시켰다(P<0.05). HGF 조절은 MSCs와 외소체 내 miR-221-5p 발현을 증가시켰으며(P<0.05), 억제제 전이는 HGF-MSCs-EXO의 자가포식 억제를 되돌렸다(P<0.05). 체내외에서 miR-221-5p 활성제 처리는 그 발현을 증가시키고(P<0.05), 병리 손상을 뚜렷이 개선하며 자가포식, 염증 및 EMT를 억제하였다(P<0.05). 이중 루시퍼레이스 및 CHIP-qPCR 실험은 miR-221-5p와 NLRP1의 표적 결합을 확인했으며, 전이 실험은 miR-221-5p 모방체가 NLRP1 mRNA 및 단백질 발현을 감소시키고 억제제는 증가시킴을 보여주었다(P<0.05). NLRP1 저하는 miR-221-5p의 조절 효과를 모방하였고, miR-221-5p 억제제는 NLRP1 저하 효과를 역전시켰다(P<0.05). 마우스 체내 검증에서 모델군 기도 조직의 NLRP1 mRNA 및 단백질 발현은 대조군보다 유의하게 높았고(P<0.05), miR-221-5p 활성제 군은 모델군보다 낮았으며(P<0.05), HGF-MSCs-EXO 군은 miR-221-5p 활성제 군보다 높았다(P<0.05). 마지막으로, HGF-MSCs-EXO+저하 대조군과 비교하여 HGF-MSCs-EXO+NLRP1 저하 군의 마우스 기도 조직에서 NLRP1 발현이 감소하였고(P<0.05), 병리 손상 개선이 더욱 뚜렷했으며 자가포식, 염증 및 EMT 지표 조절 효과도 강력하였다(P<0.05). 결론적으로, HGF-MSCs-EXO는 miR-221-5p 전달을 통해 NLRP1 발현을 표적으로 억제함으로써 자가포식 과정을 조절하고 BO 기도 상피세포의 EMT 및 염증 반응을 경감시켜 BO 치료에 새로운 잠재적 표적과 치료방향을 제공한다.

HGF-MSCs;외소체;자가포식;폐쇄성 세기관지염